Гиалуроновая кислота гликозаминогликаны. Гликозаминогликаны и протеогликаны

Гликозаминогликаны (ГАГ) - линейные отрицательно заряженные гетерополисахариды. ГАГ могут связывать большие количества воды, в результате чего межклеточное вещество приобретает желеобразный характер.

Протеогликаны - высокомолекулярные соединения, состоящие из гликозаминогликанов (90-95%) и белка (5-10%). Они образуют основное вещество межклеточного матрикса соединительной ткани и могут составлять до 30% сухой массы ткани.

ГАГ и протеогликаны специфически взаимодействуют с коллагеном, эластином, фибронектином, ламинином и другими белками межклеточного матрикса.

Функции протеогликанов и ГАГ:

1.являются структурными компонентами межклеточного матрикса;

2.участвуют в межклеточных взаимодействиях, формировании и поддержании формы клеток и органов, образовании каркаса при формировании тканей.

3.являясь полианионами, могут связывать, кроме воды, большие количества катионов (Na + , K + , Са 2+) и формировать тургор различных тканей;

4.играют роль молекулярного сита, они препятствуют распространению патогенных микроорганизмов;

5.гиалуроновая кислота и протеогликаны выполняют рессорную функцию в суставных хрящах;

6.гепарансульфатсодержащие протеогликаны способствуют созданию фильтрационного барьера в почках;

7.кератансульфаты и дерматансульфаты обеспечивают прозрачность роговицы;

8.гепарин - антикоагулянт крови;

9.гепарансульфаты - компоненты плазматических мембран клеток, где они могут функционировать как рецепторы и участвовать в клеточной адгезии и межклеточных взаимодействиях. Они также выступают компонентами синаптических и других пузырьков.

Строение и классы ГАГ

ГАГ представляют собой длинные неразветвлённые цепи гетерополисахаридов, которые построены из повторяющихся дисахаридных единиц. 1 мономером этого дисахарида является гексуроновая кислота (D-глюкуроновая кислота или L-идуроновая), 2 мономером - производное аминосахара (глюкоз- или галактозамина). NH 2 -группа аминосахаров обычно ацетилирована.

Кроме гиалуроновой кислоты, все ГАГ содержат сульфатные группы (О-эфиры или N-сульфаты).

Гиалуроновая кислота находится во многих органах и тканях. В хряще она связана с белком и участвует в образовании протеогликановов, в стекловидном теле глаза, пупочном канатике, суставной жидкости встречается и в свободном виде. В суставной жидкости гиалуроновая кислота уменьшает трение между суставными поверхностями.

Гиалуроновая кислота содержит несколько тысяч дисахаридных единиц, молекулярная масса её достигает 10 5 -10 7 Да.

Хондроитинсульфаты - самые распространённые ГАГ; они содержатся в хряще, коже, сухожилиях, связках, артериях, роговице глаза. Хондроитинсульфаты являются составным компонентом агрекана - основного протеогликана хрящевого матрикса.

Одна цепь содержит около 40 дисахаридных единиц и имеет молекулярную массу 10 4 -10 6 Да.

Кератансульфаты - наиболее гетерогенные гликозаминогликаны; отличаются друг от друга по суммарному содержанию углеводов и распределению в разных тканях.

Кератансульфат I находится в роговице глаза. Кроме повторяющейся дисахаридной единицы содержит L-фукозу, D-маннозу и сиаловую кислоту.

Кератансульфат II есть в хрящевой ткани, костях, межпозвоночных дисках. Кроме повторяющейся дисахаридной единицы содержит N-ацетилгалактозамин, L-фукозу, D-маннозу и сиаловую кислоту. Кератансульфат II входит в состав агрекана и некоторых малых протеогликанов хрящевого матрикса. В отличие от других ГАГ, кератансульфаты вместо гексуроновой кислоты содержат галактозу. Молекулярная масса одной цепи 4х10 3 - 20х10 3 Да.

Дерматансульфат широко распространён в тканях, особенно он характерен для кожи, кровеносных сосудов, сердечных клапанов. В составе малых протеогликанов (бигликана и декорина) дерматансульфат содержится в межклеточном веществе хрящей, межпозвоночных дисков, менисков. Молекулярная масса одной цепи 15х10 3 - 40х10 3 Да.

Гепарин - важный компонент противосвёртывающей системы крови. Он синтезируется тучными клетками и находится в гранулах внутри этих клеток. Наибольшие количества гепарина обнаруживаются в лёгких, печени и коже. В гепарине больше N-сульфатных групп, чем в гепарансульфате. Молекулярная масса 6х10 3 - 25х10 3 Да.

Гепарансульфат находится во многих органах и тканях, где входит в состав протеогликанов базальных мембран. Гепарансульфат является постоянным компонентом клеточной поверхности. Молекулярная масса цепи 5х10 3 до 12х10 3 Да.

Синтез ГАГ

1. На рибосомах синтезируется коровый белок, который по ЭПР поступает в аппарат Гольджи.

2. В аппарате Гольджи с участием трансфераз, локализованных на мембране, на коровом белке путём последовательного присоединения моносахаридов растет цепь ГАГ.

а). Сначала на коровом белке образуется связующий трисахарид: галактоза-галактоза-ксилоза, который может быть присоединен к коровому белку: 1). О-гликозидной связью между серином и ксилозой; 2). О-гликозидной связью между серином или треонином и N-ацетилгалактозамином; 3). N-гликозиламиновой связью между амидным азотом аспарагина и N-ацетилглюкозамином.

б). Затем, на связующем трисахариде наращивается полисахаридная цепь ГАГ. Донорами моносахаридов обычно являются соответствующие УДФ-производные: УДФ-глюкоза, УДФ-глюкуроновая кислота, УДФ-N-ацетилглюкозамин, УДФ-N-ацетилгалактозамин и т.д.

УДФ-глюкуронат образуется при окислении УДФ-глюкозы.

N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин и сиаловой кислоты синтезируются в соединительной ткани из фруктозо-6-ф (образуется из глюкозы). Источником NH 2 -группы для аминосахаров служит глутамин. Аминосахар далее ацетилируется с помощью ацетил-КоА. Затем образуются их УДФ-производные.

3. Некоторые углеводы в составе ГАГ сульфируются сульфотрансферазами, донором сульфатной группы выступает ФАФС.

4. L-идуроновая кислота образуется в составе ГАГ в результате реакции эпимеризации D-глюкуроновой кислоты.

Регуляция синтеза ГАГ

Синтез ГАГ тормозят глюкокортикоиды, половые гормоны.

Катаболизм ГАГ

ГАГ отличаются высокой скоростью обмена: Т½ многих из них составляет от 3 до 10 дней (только для кератансульфата 120 дней). Разрушение ГАГ начинается в матриксе с участием экзо- и эндогликозидаз и сульфатаз (гиалуронидаз, глюкуронидаз, галактозидаз, идуронидаз и др.). Затем, из внеклеточного пространства фрагменты ГАГ фагоцитируются клетками и гидролизуются до мономеров с участием лизосомальные гидролаз.

Мукополисахаридозы

Мукополисахаридозы - заболевания, связанные с генетическим дефектом гидролаз, участвующих в катаболизме ГАГ.

Эти заболевания характеризуются избыточным накоплением ГАГ в тканях, приводящим к деформации скелета и увеличению органов, содержащих большие количества внеклеточного матрикса. Обычно поражаются ткани, в которых в норме

синтезируются наибольшие количества ГАГ. В лизосомах при этом накапливаются фрагменты ГАГ, а с мочой выделяются олигосахариды из ГАГ.

Проявляются мукополисахаридозы значительными нарушениями в умственном развитии детей, поражениями сосудов, помутнением роговицы, деформациями скелета, низкой продолжительность жизни.

Эти болезни в настоящее время не поддаются лечению.

Гликозаминогликаны, синтезирующиеся в организме человека, вызвали особый интерес ученых. Эти соединения были получены искусственным путем и вошли в состав некоторых лекарственных средств и БАДов, которые в настоящее время широко используются в медицине. Однако мнение врачей в применении таких препаратов неоднозначно, особенно это касается хондропротекторов - препаратов для поддержания и восстановления хрящевой ткани. Рассмотрим тему детально.

Гликозаминогликаны - это натурального образования гетерополисахариды, которые чаще всего располагаются в веществе между клетками тканей и органов человека. Их можно встретить в соединительной ткани человека и в синовиальной жидкости. Гликозаминогликаны состоят из повторяющихся дисахаридных единиц. Ранее они назывались мукополисахаридами.

Эти органические соединения имеют свойство достаточно прочно связывать молекулы воды в значительном количестве, поэтому вещество, расположенное между клетками, может принимать желеобразный вид.

Гликозаминогликаны не содержатся в свободном виде, их получают путем химической обработки из биомассы, состоящей из хрящей и костного мозга молодых животных или рыб.

Физико-химические свойства и классификация

Выделяют несколько видов этих веществ, которые решают конкретные задачи. Классификация гликозаминогликанов:

1. Гиалуроновая кислота.
2. Кератансульфаты.
3. Гепарин.
4. Хондроитин сульфаты.
5. Дерматансульфат.
6. Гепарансульфат.

Гликозаминогликаны входят в состав межклеточного вещества соединительной ткани и являются обязательным компонентом межклеточного матрикса. Они способны удерживать большое количество молекул воды, благодаря чему образуют вязкие растворы в организме. Эти соединения имеют отрицательный заряд, что определяет такие их физико-химические свойства как вязкость и устойчивость к сдавлению (компрессии).

Гиалуроновая кислота в большом количестве содержится в коже человека, также она выполняет роль смазки в суставах.

Кератансульфаты обнаруживаются в межпозвоночном диске, хрящах и костной ткани.

Дерматансульфат встречается в коже и в межклеточном веществе хрящевой ткани. В печени, легких и сосудистой стенке содержится такой компонент, как гепарин.

Хондроитин сульфат обнаруживается в связках, сухожилиях и артериях.

Благодаря этим веществам в организме осуществляется ряд важных процессов. Гепарин препятствует сгущению крови и влияет на состояние иммунной системы. Протеогликаны необходимы для восстановления хрящевой ткани, а также они отвечают за циркуляцию воды в синовиальной жидкости. Хондроитинсульфат стимулирует синтез протеогликанов и коллагена. Хондроитин подавляет активность специфических ферментов, вызывающих разрушение хряща, и способствует отложению кальция в костной ткани.

Таким образом, гликозаминогликаны участвуют в следующих процессах в организме:

1. Ионный обмен.
2. Иммунные реакции.
3. Дифференцировка тканей.
4. В восстановлении клеток.
5. В опорной функции.
6. В оплодотворении.

Показания

Гликозаминогликаны нашли широкое применение в различных отраслях медицины: в офтальмологии, косметологии, ревматологии. Некоторые сульфатированные гликозаминогликаны входят в состав хондропротекторов, которые рекомендуются при заболеваниях суставов. Хондропротекторы препятствуют разрушению хрящевой ткани. Показания к назначению этих препаратов следующие:

• лечение артрозов любой локализации, в том числе остеохондроза;
• предотвращение развития артрозов после травм и операций;
• при хронических артритах.

Однако многочисленными клиническими исследованиями было доказано, что никакого воздействия на хрящ хондропротекторы не оказывают. У ряда пациентов было отмечено уменьшение болевого синдрома на фоне приема этих препаратов. Повторные исследования показали, что хондропротекторы не влияют на болевой синдром. В большинстве случаев это просто эффект «плацебо».

Интересно знать. В международных и российских стандартах лечения суставов хондропротекторов нет.

В косметологии гликозаминогликаны используются для борьбы с морщинами, регенерации тканей, смягчения кожи, роста ресниц и волос. Подкожные инъекции гиалуроновой кислоты помогают вырабатывать коллаген и эластин, благодаря чему улучшается питание и внешний вид кожи.

Противопоказания

Как и у любого соединения, вводимого в организм извне, у гликозаминогликанов есть свои противопоказания. Для хондропротекторов это:

1. Индивидуальная непереносимость.
2. Тяжелые заболевания желудочно-кишечного тракта.
3. Возраст до 12 лет.
4. Беременность и лактация.
5. Запущенные стадии артрозов (анкилозы).
6. Тромбофлебиты.

Противопоказания для использования косметики или процедур с гликозамигликанами в косметологии:

1. Аллергия на компоненты.
2. Беременность и кормление грудью.
3. Острые инфекции.
4. Злокачественные образования.
5. Склонность к формированию рубцов на коже.
6. Вирусные заболевания.
7. Проблемы со свертываемостью крови.

Обзор популярных препаратов

«Хондроитин сульфат » выпускается в виде раствора в ампулах для внутримышечного введения. Рекомендуется при , способствует восстановлению хрящевой поверхности суставов, выработке синовиальной жидкости, что улучшает подвижность сустава и уменьшает болевой синдром. К препаратам, которые также содержат сульфат, относятся «Структум», «Мукосад», «Хондроксид» и другие.

«Румалон » в виде активного вещества содержит экстракт хрящей и костного мозга молодых животных. Он усиливает синтез сульфатированных мукополисахаридов и стимулирует регенерацию суставного хряща. Назначается при дегенеративных изменениях суставах, вводится внутримышечно по схеме.

« » состоит из глюкозамина сульфата и вспомогательных веществ. Выпускается в саше для приема внутрь и в ампулах для внутримышечных инъекций. Глюкозамина сульфат тормозит развитие дегенеративных процессов в суставах, восстанавливает их функцию, уменьшая суставные боли, облегчает нормальное отложение кальция в костной ткани.

«Ангиофлюкс » состоит из смеси глюкозаминогликанов - гепариноподобной фракции и дерматансульфата. Препарат вводят внутривенно капельно. Основное показания для приёма – ангиопатия, при которой велик риск тромбообразования, микроангиопатия, к которой можно отнести нефропатию, ретинопатию, нейропатию, а также макроангиопатию при сахарном диабете.

«Гиалуроновая кислота Эвалар » содержит 150 мг препарата в одной капсуле. Относится к и рекомендуется для решения возрастных проблем, связанных с недостатком естественной влаги в тканях кожи, суставов, глаз.

Заключение

Гликозаминогликаны входят в состав многих органов и тканей человеческого организма и выполняют ряд важных функций. Они применяются для лечения ожогов, глазных заболеваний и для восстановления тканей.

В ревматологии препараты, содержащие мукополисахариды, до сих пор вызывают много споров по поводу их эффективности в воздействии на хрящевую ткань суставов. Не следует принимать подобные препараты самостоятельно, не посоветовавшись со своим лечащим врачом, который сможет подобрать адекватную схему лечения.

Компания CANINA Pharma производит препараты для профилактики и лечения артропатий.

Витамины CANINA можно заказать

АРТРОПАТИЯ (от греч. arthron—сустав и pathos—страдание), трофическое изменение сустава -может развиться, как у взрослых собак, так и у щенков средних, крупных и гигантских пород. Щенки этих пород растут быстро и достигают размеров крупных собак очень рано, но это небезопасно. Нарушения развития и формирования скелета - такие, как дисплазия тазобедренного сустава, расслаивающий остеохондрит, искривление лучевой кости, гипертрофическая остеодистрофия - являются частыми заболеваниями, связанными с ростом животного. У взрослых собак часты травматические повреждения суставов, слабость связочного аппарата, дегенеративные заболевания суставов, частным случаем которых является остеоартроз.

Остеоартроз - широко распространённое дегенеративно-дистрофическое заболевание суставов, причиной которого является поражение хрящевой ткани суставных поверхностей, а так же, субхондральной кости, связок, капсулы, синовиальной оболочки и периартикулярных мышц вплоть до полной деформации сустава и утраты им своей функции частично или полностью. Остеоартроз является результатом действия механических и биологических факторов, которые нарушают процессы образования клеток суставного хряща и субхондральной кости. Он может быть инициирован многими факторами, включая генетические, эволюционные, метаболические и травматические. В основе ОА лежат патологические изменения, возникающие вследствие нарушения нормальных процессов синтеза и деградации в хондроцитах и матриксе суставного хряща и субхондральной кости.

Наиболее частые симптомы при артрозе: постоянная хромота; сложность вставания и хроническая болевая реакция. Хромота сочетается с болевой реакцией в суставах и ограничением амплитуды движений конечностей. Она может прогрессировать, а также проявляться внезапно, вследствие незначительной травмы или во время усиленной тренировки.

Страдают остеоартрозом 20% собак в возрасте старше 1 года; более 95% случаев возникновения остеоартроза отмечают у собак в возрасте свыше 5 лет. Хромота является частым мотивом для обращения к ветеринарному врачу.

Факторы риска развития артроза

1. Возраст

В возрасте от 8 до 13 лет более половины собак страдает артрозами.

2. Размер:

· 45% собак, подверженных артрозу, имеют крупный размер, при этом гигантские породы лидируют (более половины случаев заболевания).

· 28% случаев артроза приходится на собак среднего размера.

· 27% относится к мелким породам собак.

3. Ожирение

4. Костно-суставные травмы

Хирургические операции на суставах вызывают формирование артроза.

5. Повышенная активность

6. Особенно в период роста.

Сегодня как в ветеринарной, так и в медицинской фармакотерапии для лечения и профилактики артропатий и дископатий(«грыж межпозвоночного диска») применяются различные препараты на основе гликозаминогликанов. Источником их получения является материал, как животного, так и растительного происхождения (куриные желудки, петушиный гребень, моллюски, водоросли и др.)

Гликозаминогликаны (ГАГ) - это длинные неразветвлённые молекулы полисахаридов, преимущественно состоящие из повторяющихся дисахаридных комплексов. Они представлены аминосахарами (D -галактозамином и D -глюкозамином), обычно включают уроновую кислоту.

Благодаря обилию сульфатных, а также карбоксильных групп уроновой кислоты ГАГ являются полианионами и имеют отрицательный заряд, что позволяет им связываться с белками и липидами. При этом образуются протеогликаны и гликолипиды. Именно отрицательный заряд определяет такие физико-химические свойства ГАГ, как высокая вязкость и резистентность к компрессии, что особенно важно для компонентов суставного хряща, суставной жидкости и других элементов опорно-двигательного аппарата. С другой стороны, их взаимодействие с внеклеточными макромолекулами, белками, компонентами клеточной поверхности обеспечивает структурную организацию соединительнотканного матрикса.

Наибольшую физиологическую значимость имеют такие ГАГ, как гиалуроновая кислота, хондроитин сульфат, кератан сульфат, гепарин, гепаран сульфат и дерматан сульфат.

ГАГ участвуют в реализации большого числа жизненно важных процессов и входят в состав различных тканей. Так, гепарин освобождается из гранул тучных клеток и является антикоагулянтом. В литературе есть данные о том, что он влияет на функциональное состояние Т и В лимфоцитов. Он повышает устойчивость тканей к гипоксии, стимулирует аэробную фазу метаболизма, уменьшает перекисное окисление и активность лизосомальных гидролаз, проницаемость сосудистой стенки. Гепаран сульфат играет роль эндогенного протектора эндотелия сосудов. Дерматан сульфат в значительной степени определяет структуру кожи, сосудов и клапанов сердца. Кератан сульфат входит в структуры роговицы, рыхлой соединительной ткани, скелета. Гиалуроновую кислоту и хондроитин сульфат в первую очередь выявляют в суставах. Кроме того, эти компоненты включаются в состав сухожилий, позвоночных дисков, роговицы, эндокарда, плевры, брюшины. Существует много генетически детерминированных заболеваний, которые связанны с дефектами образования и метаболизма ассоциированных с мембранами клеток ГАГ.

Учитывая роль ГАГ, как ортомолекулярного препарата в предупреждении и лечении болезней суставов, для наилучшего результата прием ГАГ-содержащих препаратов должен быть ежедневным и осуществляться длительными циклами (от 45 до 90 дней в зависимости от тяжести поражения суставов). Лечебный эффект после приема курса ГАГ- содержащего препарата сохраняется в течение 6 - 12 месяцев. Во избежание дискредитации столь ценного вещества, как ГАГ, необходимо придерживаться рекомендуемых дозировок. Однако при ожирении, приеме диуретиков дозировки должны быть увеличены. А при наличии воспалительного процесса в ЖКТ необходимо применять ГАГ-содержащие препараты вместе с кормом. Пероральные хондропротективные препараты, бесспорно, предпочтительнее для длительного лечения, чем инъекционные формы.

Сравнивая ГАГ-содержащие препараты с нестероидными противовоспалительными препаратами, которые лишь временно устраняют боль, можно отметить отсутствие серьезных побочных действий (повреждение печени и ЖКТ).

Поскольку ткани сустава имеют высокую адаптивную пластичность, выраженный положительный эффект дает применение ГАГ-содержащих препаратов в период восстановительной реабилитации после перенесенных септических артритов и как средство вспомогательной терапии в острой фазе их течения.

Важно следить за поступлением ГАГ в составе хондропротекторов стареющим животным. В этот период жизни функциональные возможности хондроцитов к синтезу хондроитин-4-сульфата снижены, и этот компонент замещается другими элементами с ухудшением качественных характеристик хрящевой ткани. Было также показано, что хондроитин-4-сульфат положительно влияет на сердечно-сосудистую систему. Он высвобождается тромбоцитами и участвует в регуляции свёртывания крови, препятствуя образованию тромбов, вызывающих нарушение микроциркуляции в тканях. Следовательно, назначение хондропротекторов позволяет смягчить проблемы связанные с нарушением функциональной деятельности опорно-двигательного аппарата и других систем организма в этот возрастной период. При этом создаются благоприятные метаболические условия для восстановления клеток при действии на них неблагоприятных факторов. Это актуально для растущих животных, когда идёт интенсивный синтез хряща, а также при возрастной патологии, когда снижено образование компонентов хряща.

Наряду с успешным применением ГАГ-содержащих препаратов при лечении суставных патологий, в последнее время гликозаминогликан нашел применение в эндокринологии, а именно в лечении диабетической нефропатии, которая является грозным осложнением сахарного диабета. До недавнего времени единственным патогенетическим средством, способным устранять внутри клубочковую гипертензию, т.е. воздействовать на ведущий механизм развития поражения почек, рассматривались ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ). Гипергликемия вызывает нарушение структуры базальных мембран клубочков почек, что сопровождается снижением синтеза основных структурных компонентов - гликозаминогликанов. Это приводит к потере базальной мембраной зарядоселективности, вследствие чего молекулы альбумина проникают через почечный фильтр. Для восстановления базальной мембраны целесообразно применение ГАГ-содержащих препаратов..

Дискутируется нефропротективный эффект гликозаминогликанов, в том числе их способность тормозить воздействие склеротических процессов в почках, восстанавливать образование гепарансульфата - важнейшего структурного элемента базальной мембраны почек.

Сырьем для производства немецкими специалистами ГАГ-содержащих препаратов и послужил моллюск Perna canaliculus. Это разновидность мидий, вылавливаемых у побережья Новой Зеландии. Было замечено, что у людей, потреблявших эти мидии, в меньшей степени возникали дегенеративные изменения и воспаления в области суставов (Anderson, 1999, Vaughan-Scott, 1997). Традиционно популяция населения Майори регулярно использует в питании мидии на протяжении веков. Они в меньшей степени страдают артрозом в отличие от населения, живущего в центральной части этой территории. Этот морепродукт содержит высокую концентрацию гликозаминогликанов, хондроитина сульфата, а так же незаменимых омега - 3 жирных кислот и антиоксидантов.

В защиту высокой стоимости препарата относительно аналогов можно отметить несопоставимо большую биогенность активного действующего вещества препарата к соединительнотканным структурам организма животного. Важным преимуществом (Canina pharma GmbH) и является наличие в его составе большего количества действующих компонентов: гиалуроновой кислоты, хондроитин - 4 - сульфат, хондроитин - 6 - сульфат, дерматансульфат, кератансульфат, гепаринсульфат и гепарансульфат. Уже через 14 дней наблюдается положительный эффект, но важно помнить, что только при систематическом применении возможно получение стойкого положительного эффекта.

Выводы:

1. Препараты , либо т.к. эти препараты содержат неодинаковое количество действующего вещества.

5. и являют собой альтернативу применению НСПС.

6. GAG включает в себя биологически активные вещества, необходимые для восстановления структуры базальной мембраны почек при диабетической нефропатии.

7.Элементы, добавляемые в рацион, могут модулировать воспалительные процессы, вовлеченные в развитие артроза. Они также индуцируют репарацию хрящевой ткани поверхности суставов и защищают организм от стрессов, вызываемых окислением.

Углеводсодержащие белки

Выделяют два подкласса белков, содержащих углеводы: протеогликаны и гликопротеины. Между этими подклассами имеются существенные отличия:

Для гликопротеинов характерна структурная роль

Способы присоединения углевода к белку.

Гликопротеины - белки, содержащие в качестве простетической группы небольшое количество углеводов (до 15 %), присоединенных к аминокислотным радикалам ковалентными связями. В составе углеводной части определяются гексозы (галактоза, манноза, редко глюкоза), пентозы (ксилоза, арабиноза), дезоксисахара (фукоза, рамноза), аминосахара (ацетилгалактозамин, ацетилглюкозамин), нейраминовая кислота и ее уксуснокислые эфиры (сиаловые кислоты). Они присоединены либо N-гликозидной связью к амидному азоту аспарагина, либо О-гликозидной связью к гидроксигруппе остатка серина, треонина, гидроксилизина. Большинство этих белков обладает слабовыраженными кислыми свойствами. В группе гликопротеинов выделяют серомукоиды (серо­гликоиды), обладающие выраженными кислыми свойствами и растворимых в хлорной, трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотах. Эта фракция, составляя 1 % всех белков сыворотки, включает 12 % всех углеводов плазмы.

Функции гликопротеидов

Схема строения белка-рецептора.

• Структурная - клеточная стенка бактерий, костный матрикс, например, коллаген, эластин;
• Защитная - например, антитела, интерферон, факторы свертывания крови (протромбин, фибриноген);
• Рецепторная - присоединение эффектора приводит к изменению конформации белка-рецептора, что вызывает внутриклеточный ответ;
• Гормональная - гонадотропный, адренокортикотропный и тиреотропный гормоны;
• Ферментативная - холинэстераза, нуклеаза;
• Транспортная - перенос веществ в крови и через мембраны, например, трансферрин, транскортин, альбумин, Na + ,К + -АТФаза.

Протеогликаны

Другая группа гликоконъюгатов - протеогликаны - характеризуется наличием крупных полисахаридов, состоящих из повторяющихся дисахаридных остатков. Это гидрофильные соединения, в состав которых входит 20‑80 % углеводов. Углеводные компоненты протеогликанов называют гликозаминогликанами. Выделяют 7 типов гликозаминогликанов, из них 5 типов содержат в своем составе глюкуроновую кислоту (к ним относятся гиалуроновая кислота, хондроитин-4‑сульфат и хондроитин-6‑сульфат, гепарин и гепарансульфат), шестой тип (дерматансульфат) содержит идуроновую (галактуроновую) кислоту, седьмой (кератансульфат) - галактозу. Сиаловые кислоты, манноза, ксилоза присутствуют в минимальном количестве. Протеогликаны имеют сильно выраженные кислотные свойства благодаря наличию большого числа карбоксильных групп и остатков серной кислоты. Дисахариды включают в себя какую-либо уроновую кислоту и аминосахар. Многократно дублируясь, дисахариды образуют олиго- и полисахаридные цепи - гликаны. Для углеводной части встречаются другие названия - кислые гетерополисахариды (так как имеют много кислотных групп), гликозаминогликаны (содержат аминогруппы). Избыток анионных групп (сульфатных, карбоксильных) придает молекулам гликозаминогликанов высокий отрицательный заряд.

Строение гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата.

Основными представителями структурных гликозаминогликанов являются гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, кератансульфаты и дерматансульфаты. Эти молекулы входят в состав протеогликанов, функцией которых является заполнение межклеточного пространства и удержание здесь воды, также они выступают как смазочный и структурный компонент суставов и других тканевых структур.

Углеводная часть, аналогично с гликопротеинами, связывается с белком через остатки серина и аспарагина.

Схема строения протеогликанов межклеточного вещества.

Функции протеогликанов

По функции структурные протеогликаны значимы для межклеточного пространства, особенно соединительной ткани, в которое погружены коллагеновые волокна. При помощи электронной микроскопии выяснено, что они имеют древовидную структуру. Молекулы гликанов весьма гидрофильны, создают сетчатый желеподобный матрикс и заполняют пространство между клетками , являясь преградой для крупных молекул и микроорганизмов.

Еще одним представителем протеогликанов является гепарин, включающий несколько сульфатированных цепей гетерополисахарида, связанного с белковым ядром через остатки серина. В крови гепарин связывается с антитромбином III, образуя комплекс, блокирующий факторы свертывания крови IIа, IХа, Ха, XIa и ХIIа, что применяется для профилактики тромбозов у больных различного профиля. В настоящее время используются препараты низкомолекулярных гепаринов и нефракционированных гепаринов, обладающие лучшими характеристиками.

Также функцией гепарина является активирующее влияние на активность фермента липопротеинлипазы, участвующего в метаболизме транспортных форм липидов в крови (хиломикроны и липопротеины очень низкой плотности). Как следствие, количество липидов в крови снижается.

Методы исследования содержания углеводсодержащих белков

При исследовании содержания углеводсодержащих белков возможно использование нескольких методических подходов:

Различие в окраске после проведения карбазоловой и орциновой реакций позволяет судить об относительном содержании дерматансульфата в пробе. Для чистого образца дерматансульфата отношение содержания гликозаминогликанов по карбазоловой реакции к их концентрации, определенной по орциновой реакции, равняется 0,67. При наличии других гликозаминогликанов (кроме кератансульфата) коэффициент возрастает.

В качестве унифицированных утверждены резорциновый метод определения концентрации сиаловых кислот и орциновый метод определения всех гексоз, входящих в состав гликопротеинов, и гексоз, связанных с серогликоидами.

Резорциновый метод определения концентрации сиаловых кислот (по Свеннерхольму)

Принцип

При нагревании гликопротеинов плазмы с трихлоруксусной кислотой отщепляются сиаловые кислоты, которые в свою очередь гидролизуются с образованием нейраминовой кислоты. Резорцин в присутствии солей меди в солянокислой среде дает с нейраминовой кислотой синее окрашивание.

Нормальные величины

Концентрация сиаловых кислот в крови возрастает при различных воспалительных процессах (эндокардите, остеомиелите), при туберкулезе, лейкемии, лимфогранулематозе, нефрозе, резко повышается при опухоли головного мозга, инфаркте миокарда, увеличивается при поражении паренхимы печени, коллагенозах, при других процессах, протекающих с деструкцией соединительной ткани.

Снижение сывороточного уровня сиаловых кислот отмечается у больных с пернициозной анемией, гемохроматозом, болезнью Вильсона и дегенеративными процессами в ЦНС.

Определение содержания серомукоидов и общего количества гликопротеинов орциновым методом

Принцип

Гликопротеины осаждают вместе с белками сыворотки или плазмы крови спиртом, осадок отмывают, растворяют в щелочи и после гидролиза серной кислотой определяют концентрацию гексоз по реакции с орцином, что соответствует содержанию гликопротеинов.

Для определения серомукоидов белки осаждают хлорной кислотой, при этом серомукоиды не осаждаются. Затем из надосадочной жидкости осаждают серомукоиды при помощи фосфорновольфрамовой кислоты, осадок отмывают и после растворения его в щелочи определяют уровень гексоз.

Нормальные величины

Клинико‑диагностическое значение

Количество гексоз гликопротеинов увеличивается при разнообразных воспалительных процессах: туберкулезе, плеврите, пневмонии, остром ревматизме, гломерулонефрите, при диабете, инфаркте миокарда, подагре, злокачественных новообразованиях. Особое значение определение концентрации гликопротеинов имеет при вяло текущих заболеваниях, при этом возрастание активности свидетельствует об активации процесса, хотя клинические симптомы еще могут не проявляться.

Реакция альцианового синего с реакционными группами субстрата основана на свойстве молекул красителя взаимодействовать с отрицательно заряженными группами субстрата и располагаться перпендикулярно к продольной оси. Если содержание ГАГ в исследуемых структурах низкое, перед окраской проводят карбоксиметилирование. Алкилирование, происходящее по воздействием метилиодида блокирует все карбоксильные группы, оставляя неизменными сульфатные, что улучшает качество реакции.

Методика выявления кислых гликозаминогликанов по Стидмену:

1. депарафинированные срезы довести до воды.

2. нанести 0,1% раствор альцианового синего на 10 мин.

3. промыть в дистиллированной воде.

4. окрасить гематоксилином Майера 3-5мин.

5. промыть в водопроводной воде 2-3 мин.

6. провести по батарее спиртов, через ксилол 1, ксилол 2, и минуя

карбол/ксилол заключить срезы в канадский бальзам.

Результат: кислые ГАГ окрашиваются в сине-голубой цвет.

Занятие 4. Освоение методики выявления коллагена по Маллори

(2 Часа).

Избирательность метода обусловлена специфическим связыванием молибденовой кислоты с коллагеновыми волокнами с последующим присоединением обычных сульфированных красителей.

Используя комплекс визуализации и анализа изображения получить и разместить фотографию политенных хромосом, отметить их характерные морфологические признаки.

Методика выявления коллагена по Маллори:

окрасить 0,1% раствором кислого фуксина -3 мин;

промыть в дистиллированной воде и зафиксировать окраску 1%

раствором фосфорно-молибденовой кислоты;

промыть в дистиллированной воде

окрасить сложным красителем в течение 2 мин* ;

промыть в дистиллированной воде;

дифференцировать в 96 0 спирте;

провести по батарее – абсолютный спирт, ксилол 1, ксилол 2, заключить в

Результат : коллагеновые и ретикулиновые волокна темно-синие, слизь

синяя, эритроциты красно-оранжевые, мышечная ткань ярко-

оранжевая, хроматин красный или тёмно-коричневый.

Приготовление рабочего раствора красителя : к 0,5 г анилинового синего + 2 г оранжевого + 2 г щавелевой кислоты и растворить в 10 мл дистиллированной воды. Прокипятить, остудить и профильтровать.

Занятие № 5. Освоение методики выявления митохондрий по Альтману (2 часа).

Методика выявления митохондрий по Альтману:

депарафинированные срезы довести до воды;

нанести в избытке готовый раствор кислотного фуксина на анилиновой

нагреть стекло над пламенем спиртовки до появления паров и остудить.

Эту операцию повторяют 1-2 раза; после окончательного охлаждения

избыток рас­твора красителя слить;

дифференцировать в трех порциях пикриновой кислоты;

провести по батарее – 96 0 , абсолютный спирт, ксилол 1, ксилол 2 и минуя карбол/ксилол заключить в бальзам.

Результат: мито­хондрии – резко красные на желтоватом фоне.

Примечания . Наибольшую трудность представляет дифференцировка в пикриновой кислоте. Если она прервана слишком рано, то митохондрии и протоплазма остаются окрашенными в одинаковый красный цвет; если она прервана слиш­ком поздно, то митохондрии уже недостаточно выделяются на фоне обесцве­тившейся протоплазмы.

Используя комплекс визуализации и анализа изображения получить и разместить фотографию первичной культуры клеток, окрашенную по Альтману, обозначить локализацию митохондрий в клетке.

Приготовление раствора красителя . В 100 см 3 анилиновой воды растворяют в 20 г кислого фуксина, так как стойкость раствора очень ограничена (около 24 час), то лучше приготовлять лишь 10 см 3 .

Раствор I : пикриновая кислота, насыщенная на абсолютном спирте 10 см 3 , 20-градусный спирт 40 см 3 . Раствор II : пикрино­вая кислота, насыщенная на абсолютном спирте 10 см 3 , 20-градусный спирт 70 см 3 . Первым раствором наполняют два стаканчика: один, чтобы смыть избыток раствора красителя (около 15 сек.); второй для следующей за этим дифференцировки. Дифференцировку заканчивают в третьем стаканчике с раствором II (1-3 мин.)